User:Raifedora/sandbox

= Klasifikasi Kordiimonas gwangyangensis berdasarkan sekuen 16s rRNA = Tugas Bioinformatika Kelompok 5

Kordimonas gwangyangensis adalah bakteri laut dengan galur GW 14-5 berhasil diisolasi dari daerah sedimen teluk Gwang Yang, Korea. Bakteri ini mampu mendegradasi senyawa polisiklik aromatik hidrokarbon dengan berat molekul besar. Analisis filogenetik dilakukan berdasarkan gen 16S rRNA yang menunjukkan indikasi bahwa bakteri ini berada dalam ordo selain tujuh ordo bakteri lain dalam kelas Alphaproteobacteria. Alphaproteobacteria sebelumnya memiliki tujuh ordo, yaitu Caulobacterales, Rhizobiales, Rhodobacterales,Rhodospirillales, Rickettsiales, Sphingomonadales, dan ''Parvularculales. ''Sebagian bakteri yang tergabung dalam kelas ini berasal dari laut dan dapat bertahan dalam lingkungan oligotrofik.

Klasifikasi
Phylum  : Proteobacteria

Classis  : Alphaproteobacteria

Ordo      : Kordiimonales

Genus   : Kordiimonas

Species : Kordiimonas gwangyangensis

Ciri-ciri koloni
Pada cawan petri, koloni Kordiimonas gwangyangensis berwarna putih seperti krim, berlendir, kecil, berbentuk bulat dan translusen.

Isolasi Isolat Kordiimonas gwangyangensis
Sumber isolat yang digunakan sedimen laut yang ada di teluk Gwangyang, Laut selatan Republik Korea.

Cara Isolasi :
Sebanyak 1 gram sedimen diperkaya dengan 100 ppm pyrene dan benzo[a]pyrene (BaP) dalam medium cair MM2. Metode pengkayaan dilakukan selama 2 tahun  pada suhu 10-30 °C.

Komposisi medium cair MM2:

(NH4)2SO4 18 mM; FeSO4.7H2O1 mM; 100 ml larutan buffer KH2PO4/Na2HPO4 1 M dalam 1 liter air laut, pH 7,2

Setelah itu, campuran slurry yang diperoleh didilusi dan diambil sebanyak 100 µl untuk di-plating pada marine agar 2216 (MA; Difco).

Karakterisasi
Sifat bakteri (gram positif/negatif) ditentukan dengan Bio-Rad Gram-Staining kit dan motilitas sel dilihat dengan mikroskop optik melalui metode hanging drop. Ukuran dan morfologi sel ditemukan setelah didehidrasi dan didapatkan dengan mikroskop elektron pada 10kV. Suhu pertumbuhan diuji pada kisaran 12-48 ˚C dengan interval 4 ˚C pada marine broth di temperature gradient incubator. Karakter fisiologis dan biokimia suspensi bakteri dicari menggunakan tes API 20NE dan plat Microlog GN2 pada larutan 2% garam laut. Hasil karakteristik fisiologis, biokimia, dan morfologis strain GW14-5 dapat dilihat pada tabel.

Isolat yang diperoleh dikultivasi selama 2-3 hari pada suhu 30 °C pada media MA untuk karakterisasi morfologi dan biokimia.

Penentuan laju degradasi BaP oleh strain GW 14-5T
Metode yang digunakan adalah metode fluorimetri. BaP 40 ppb dan 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin 1% dilarutkan dalam medium cair MM2 dan kemudian diinokulasi dengan strain GW 14-5T. Intensitas relatif dari fluoresensi (eksitasi pada 293 nm, emisi pada 406 nm) diukur setelah inkubasi hari ke-1, 3,4, dan 10.

Penentuan laju degradasi hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH)
Senyawa PAH terdiri dari fluorine, phenanthrene, anthracene, pyrene, chrysene, dan BaP. Metode penentuan laju degradasi yang digunakan adalah metode GC sesuai dengan Sohn et al. (2004). Masing- masing senyawa PAH diinkubasi pada suhu 30 °C selama kurang lebih 1 minggu. Penentuan laju degradasi hidrokarbon aromatik polisiklik ini diulang sebanyak tiga kali.

Metode pembuatan

 * 1) Program Ugene dibuka, lalu klik File. Setelah itu, klik New Project.
 * 2) Pada kotak dialog Create new project, isi nama proyek pada Project name, tentukan letak file proyek dalam Project folder, dan format file dalam Project file.
 * 3) Untuk mengunduh sekuen yang akan digunakan, klik File, lalu pilih Access remote database.
 * 4) Semua accession number yang akan digunakan diketik pada kotak dialog yang muncul. Setiap accession number dipisahkan dengan spasi. Dipastikan bahwa komputer terhubung dengan internet.
 * 5) Ugene akan mengunduh semua sekuen berdasarkan accession number secara otomatis. Pada kolom sebelah kiri akan muncul sekuen-sekuen yang telah diunduh.
 * 6) Setelah semua sekuen terunduh, semua sekuen ditandai, kemudian klik kanan pada mouse, lalu pilih Export/Import. Setelah itu, pilih Export sequence as alignment.
 * 7) Kotak dialog Export sequence as alignment akan muncul, tentukan tempat penyimpanan alignment dan nama file pada baris Export to file. Setelah itu, klik Export.
 * 8) Akan muncul tampilan layar hasil alignment seperti yang tertera di bawah ini.
 * 9) Untuk melakukan multiple alignment menggunakan ClustalW, pilih menu Actions, lalu pilih Align, kemudian pilih Align with ClustalW.
 * 10) Kotak dialog Align with ClustalW akan muncul, klik Align.
 * 11) Hasil alignment akan muncul. Gaps harus dibuang dengan cara memblok bagian yang akan dibuang, lalu klik delete pada keyboard. Pembuangan gaps dilakukan terutama pada bagian awal dan akhir sekuen.
 * 12) Untuk membuat pohon filogenetik, pilih ikon Build Tree.
 * 13) Pada kotak dialog, Build Phylogenetic Tree, pilih PHYLIP Neighbor Joining pada dropdown menu Tree building method. Distance matrix yang digunakan adalah Jukes-Cantor. Klik radio box Bootstrapping and Consensus Tree, jumlah replika yang digunakan adalah 1000, kemudian klik Build.
 * 14) Pohon filogenetik akan dibuat. Tampilan dapat diubah dengan menyesuaikan pengaturan pohon di kolom sebelah kanan.
 * 15) Untuk menyimpan pohon filogenetik, pilih ikon yang berada di paling kanan seperti pada gambar dibawah ini, lalu pilih Screen Capture.
 * 16) Gambar pohon filogenetik dapat disimpan dalam format JPEG atau format lainnya sesuai keinginan. Ketik nama gambar pada baris File Name, lalu klik OK.

Analisis dengan BLAST
Hasil analisis dengan BLAST menunjukan GW14-5 termasuk dalam Alphaproteobacteria dan kerabat terdekatnya adalah Blastochloris sulfoviridis dengan kesamaan 92%. Namun, setelah menggunakan manual alignment, kesamaan menurun menjadi 89,3%. Oleh sebab itu, spesies ini dipisahkan pada pohon filogenetik. Begitu juga dengan spesies lain yang termasuk di dalam Rhizobiales, yaitu Rhodobium orientis (91,5 %), Methylosinus trichosporium (91,4 %), Blastochloris viridis (90,9 %), Phyllobacterium myrsinacearum (90,8 %), dan Parvibaculum lavamentivorans (90,6 %). Bakteri yang termasuk dalam Rhodobacterales, Paracoccus alkaliphilus (91,0 %), dan Amaricoccus macauensis (90,4 %) juga memiliki kekurangan kurang dari 92%.

Alignment dengan PHYDIT
Penelitian dilanjutkan dengan mensejajarkan sekuen gen 16s rRNA dengan 7 ordo Alphaproteobacteria lain yang diambil dari database NCBI dan RDP menggunakan program PHYDIT versi 3.2 dengan pendekatan Jukes & Cantor berdasarkan metode NJ. Hasil pohon filogenetik menyatakan strain GW14-5 mempunyai perbedaan dengan ordo Alphaproteobacteria yang lain.

Penentuan laju degradasi BaP oleh strain GW 14-5T
Fluoresensi dari BaP dalam medium kultur menurun secara signifikan selama periode inkubasi bila dibandingkan dengan kontrol (tidak diinokulasi).

Penentuan laju degradasi hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH)
Laju degradasi senyawa relatif diperoleh terhadap kontrol yang tidak diinokulasi, yaitu fluorene 42,1±19,2%; phenanthrene 20,8±16,7%; anthracene 13,9±14,3%; pyrene 18,1±11,2%; dan BaP 28,0± 4,8%.

Chrysene tidak terdegradasi selama waktu inkubasi.

Hasil karakterisasi fisiologi dan biokimia
Perbedaan GW14-5 dengan ordo lain dapat dilihat dari strain Sphingomonadales, Rhodospirillales, dan Rhizobiales yang memiliki pigmen fotosintetik, namun tidak dengan GW14-5. Strain ini tidak bersimbiosis dengan akar tanaman seperti Mesorhizobium loti dan memiliki asam lemak dominan berupa asam iso-heptadecenoic, tidak seperti kebanyakan Alphaproteobacteria lainnya yang memiliki octadecenoic acid. Strain ini memiliki rasio GC yang sama seperti Rickettsia prowazekii, tetapi tidak membutuhkan inang untuk tumbuh.

Deskripsi Kordiimonadales ord. nov.
Kordiimonodales dibentuk dari penamaan genus Kordiimonas dengan menambahkan -ales pada akhir kata untuk menunjukkan tingkat takson ordo.

Deskripsi Kordiimonas gen. nov.
Kordiimonas berasal dari kata KORDI, yang merupakan singkatan dari '''Korea Ocean Research and Development Institute. '''Bakteri dalam genus ini memiliki karakteristik Gram negatif, motil, dan berbentuk batang dengan ukuran 1,3-1,4 µm dengan lebar 0.25 µm. Bakteri ini memiliki aktivitas oksidase dan katalase positif. Selain itu, bakteri ini merupakan obligat aerob, dan halofil lemah. Bakteri ini juga merupakan bakteri mesofil dan tumbuh optimum pada pH netral. Asam lemak yang diproduksi sebagian besar bercabang. Kuinon untuk pernapasan adalah MK-5. Secara filogenetik, genus ini membentuk ordo baru, Kordiimonodales yang termasuk dalam kelas Alphaproteobacteria. Spesies yang dikenal dalam genus ini adalah ''Kordiimonas gwangyangensis. ''

Deskripsi Kordiimonas gwangyangensis sp. nov.
gwangyangensis dalam K. gwanygangensis berasal dari tempat diperolehnya isolat ini, yaitu teluk Gwang Yang, Korea. Koloni bakteri ini berbentuk bulat kecil dengan diameter 2-3 mm setelah seminggu, translusen, dan berwarna krim putih. Suhu tumbuhnya berkisar antara 17 - 44oC dengan suhu optimum 37-40oC. pH optimumnya berkisar antara 6-8.5 dengan pH optimum 7. Konsentrasi garam optimum untuk pertumbuhannya adalah 2%. Bakteri ini tidak dapat tumbuh apabila konsentrasi garam lebih dari 4% atau kurang dari 0.5%.

Bakteri ini tidak mereduksi nitrat menjadi nitrit. Kandungan GC pada genomnya adalah sekitar 39.3%. Uji β-glukosidase menunjukkan hasil positif. Hasil positif juga ditunjukkan pada uji asimilasi glukosa, N-asetilglukosamin, dan maltosa. Uji lain dalam API 20NE menunjukkan hasil negatif.

Berdasarkan sistem Microlog, strain ini dapat mengoksidasi α-siklodekstrin, dextrin, Tweens 40 dan 80, N-acetylglucosamine, cellobiose, α-D-glukosa, maltosa, D-trehalosa, metil piruvat, asam β- hidroksibutirat, L-alanil glisin, asam L-aspartat, asam L-glutamat, asam glisil-L-glutamat, L-threonin, putrescine, dan glukosa 1-fosfat.

Asam lemak dominan bakteri ini adalah i-17 : 1 (46,2 %), i-15 : 0 (15,1%) and i-17 : 0 (12,6 %).

Referensi
Kwon KK, Lee HS, Yang SH, Kim SJ. 2005. Kordiimonas gwangyangensis gen. nov., sp. nov., a marine bacterium isolated from marine sediments that forms a distinct phyletic lineage (Kordiimonadales ord. nov.) in the ‘Alphaproteobacteria’. ''IJSEM ''55(5):2033-2037.